分子诊断行业研究技术篇
01
分子诊断介绍
分子诊断是指以DNA和RNA为诊断材料，应用分子生物学方法，通过检测受检个体或其携带的病毒、病原体的遗传物质的结构或表达调控的变化水平，为疾病的防治、预测、诊断、治疗和预后判断提供信息和决策依据的技术。
其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、量的多少及表达功能是否异常，以确定受检者有无基因水平的异常变化，对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。通俗简单的讲所有基于分子生物学水平的方法学技术都属于分子诊断技术，比如PCR技术、基因测序技术等等。
·PCR技术即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，基本原理类似于DNA的天然复制过程，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性，模板DNA与引物的退火(复性)，引物的延伸。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。由年美国Mullis首先提出设想，年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。简单讲PCR技术本质上是针对DNA片段进行扩增放大，通过实时荧光PCR技术使得样本中DNA含量可以检测出来。
·基因测序技术即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert（）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。简单讲基因测序技术是针对DNA片段进行测序和分析，使得DNA序列得以清晰。
狭义的分子诊断是基于核酸的诊断技术。随着基因组学、蛋白组学、代谢组学等新兴学科的发展，分子诊断的内涵已经从DNA/RNA拷贝、突变等检测，拓展到核酸与DNA片段、蛋白与多肽、抗原与抗体、受体与配体等生物大分子的检测。从目前市场分子诊断产品来看，基于核酸诊断技术的产品仍占主要。
02
分子诊断技术发展
分子诊断主要包括原位杂交(insituhybridization，ISH)、荧光原位杂交技术（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）、聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)、基因芯片和基因测序（如下图所示）等。
其发展大致经历了四个阶段。第一阶段是20世纪80年代基于原位杂交技术的遗传病诊断；第二阶段是20世纪90年代基于PCR技术，特别是实时定量PCR和数字PCR的分子诊断；第三阶段是基于基因芯片的多指标、高通量基因检测；第四阶段是基于基因测序技术在无创产前检测、遗传性肿瘤筛查及肿瘤个体化用药指导等方面的应用。
目前临床应用最广泛的分子诊断技术为聚合酶链式反应（PCR）技术，以及荧光原位杂交（FISH）技术。数字式PCR（DPCR）实现对核酸分子的绝对定量，可直接读出DNA分子的个数，是PCR检测中最先进的技术。高通量测序（NGS）作为新兴的分子诊断技术，可以同时检测多个基因位点，在肿瘤伴随诊断中具有较大的优势。基因芯片的核心原理是分子杂交，但是具有高通量的特点，可以一次对十几万甚至几百万条DNA分子序列进行检测，远高于杂交技术的检测量。
03
分子诊断技术细分研究
3.1原位杂交技术
上世纪60年代至80年代是分子杂交技术发展最为迅猛的20年，由于当时尚无法对样本中靶基因进行人为扩增，人们只能通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。其中液相和固相杂交基础理论、探针固定包被技术与cDNA探针人工合成的出现，为基于分子杂交的体外诊断方法进行了最初的技术储备。
（1）DNA印迹技术(Southernblot)
Southern于年发明了DNA印迹技术，通过限制性内切酶将DNA片段化，再以凝胶电泳将长度不等的DNA片段进行分离，通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上，再使膜上的DNA变性与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交，经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA片段-探针间的同源序列。这一方法由于同时具备DNA片段酶切与分子探针杂交，保证了检测的特异性。因此，一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法，广为运用于各种基因突变，如缺失、插入、易位等，及与限制性酶切片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)的鉴定中。Alwine等于年推出基于转印杂交的Northernblot技术也同样成为当时检测RNA的金标准。
（2）ASO反向斑点杂交(allele-specificoligonucleotidereversedotblot，ASO-RDB)
使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性，但存在操作极为繁琐，检测时间长的缺点。年建立的样本斑点点样固定技术则摆脱了传统DNA印迹需要通过凝胶分离技术进行样本固定的缺点。通过在质粒载体导入单碱基突变的方法，构建了首条等位基因特异性寡核苷酸探针(allele-specificoligonucleotide，ASO)，更使对核酸序列点突变的检测成为可能。年，Saiki首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结合起来，实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测，Saiki又发明了ASO-RDB，通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色，进行基因分型、基因突变的检测。该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上，只需通过1次杂交反应，即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因，具有操作简单、快速的特点，一度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。
（3）荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)
FISH源于以核素标记的原位杂交技术，年Rudkin首次使用荧光素标记探针完成了原位杂交的尝试。在上世纪年代，细胞遗传学和非同位素标记技术的发展将FISH推向临床诊断的实践应用。相比于其它仅针对核酸序列进行检测的分子诊断技术，FISH结合了探针的高度特异性与组织学定位的优势，可检测定位完整细胞或经分离的染色体中特定的正常或异常DNA序列；由于使用高能量荧光素标记的DNA探针，可实现多种荧光素标记同时检测数个靶点。
如今，FISH已在染色体核型分析，基因扩增、基因重排、病原微生物鉴定等多方面中得到广泛应用。通过比较基因组杂交(
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