单细胞图谱解析转移性胃腺癌的瘤内异质性和

.08.09

本期主题：

单细胞测序与谱系多样性

单细胞图谱解析转移性胃腺癌的瘤内异质性和谱系多样性

单细胞图谱解析转移性胃腺癌的瘤内异质性和谱系多样性。德克萨斯大学MD安德森癌症中心王淩华团队和JafferAjani、宋淑梅团队合作在NatureMedicine杂志上发表了文章：single-celldissectionofintratumoralheterogeneityandlineagediversityinmetastaticgastricadenocarcinoma。

在这项研究中，研究人员对20例晚期胃癌腹腔转移病人腹水中的肿瘤细胞做了单细胞转录组学的解析，首次揭示了胃癌病人肿瘤内部异质性的细胞起源。通过比较长生存期患者和短生存期患者的腹水肿瘤细胞，发现了肿瘤细胞谱系组成并开发了一种基因标签，其预测患者的生存能力优于各种临床特征。

导读

胃癌（gastricadenocar-cinoma(GAC)）的发病率和致死率高居消化道恶性肿瘤前列。胃癌患者发现时多为晚期，且多伴有腹腔转移(peritonealcarcinomatosis(PC))，此类患者预后较差，总体生存时间不足6个月，且普遍对化疗和免疫治疗耐药。只有一小部分患者从免疫检查点和Her2靶向治疗中获益，且持续短暂。目前，人们在分子水平上对于晚期胃癌的了解仍然非常有限，TCGA将胃癌分成4种分子分型，但分型来源于原发的GACs，其中EBV阳性和微卫星不稳定型原发胃癌具有较好的预后。然而，这两种类型在晚期胃癌中非常罕见。

临床上，针对晚期胃癌患者的合理疗法十分有限，因此亟需改善胃癌治疗方案以改善患者的生存状况。众所周知，胃癌患者存在个体差异，胃癌本身具有高度肿瘤内异质性(intra-tumorheterogeneity,ITH)。ITH越高，越容易耐药，癌症进展越快，预后越差。这就像生态系统一样，越多样越强大，越不易消亡。然而，人们对肿瘤内部异质性的细胞起源知之甚少。深入了解胃癌ITH的细胞或分子基础有助于改善胃癌患者的治疗策略。近年来高速发展的单细胞测序技术为人们更好地了解肿瘤内细胞异质性提供强有力的支持。

研究内容

研究者共收集了来自20名伴有腹腔积液的胃癌晚期患者的腹腔转移细胞，进行了3?的10x单细胞RNA测序分析。其中10名是长生存期患者（自腹腔转移诊断起，生存时间12个月以上），10名短生存期患者（自腹腔转移诊断起，生存时间6个月以内）。经过质量控制后，得到了45,个单细胞的基因表达数据。研究者应用常用基因标志识别出了上皮细胞、B细胞、CD4T细胞、CD8T细胞、髓细胞、和成纤维细胞，并集中分析了31,个腹水肿瘤上皮细胞。

进一步分析恶性肿瘤细胞的分群，发现细胞亚群按照患者特异性分群，这表明肿瘤中存在的异质性。同时按照生存期分组，同一生存时间患者的细胞亚群距离较近，表明不同的转录组谱可能与生存相关。

在细胞注释和来源分类的分析过程中，在排除了数据缺失，双细胞，细胞周期和技术噪声的影响之后，研究人员发现了一个有趣的现象：尽管所有的标本来源于晚期腹腔转移胃癌病人的腹水,但只有69.5%的PC胃肿瘤细胞为胃部来源，包括陷窝细胞(47%)，黏膜细胞(22%)和主细胞(0.5%)。然而，PC肿瘤细胞的一个子集(26%)的表达谱在转录组上与其他胃肠道(GI)器官的细胞相似，特别是肠道(21%)。这说明，晚期胃癌腹腔转移肿瘤的来源不止是胃部癌细胞起源。

研究人员通过病理组织切片找到了两例(IP-和IP-)混合了胃和结肠上皮细胞(包括结肠杯状细胞)的样品对应的原发GACs的组织学图像，证实了胃黏膜中存在形态良好的杯状细胞，证实肿瘤发生在胃肠上皮化生的环境中

以上结果说明了胃癌的谱系多样性，通过进一步的单细胞综合分析发现，肿瘤细胞CNV亚克隆、转录组聚类、基因组突变和推测的细胞谱系起源有关。

1.转录组：

通过UMAP图上着色细胞进行聚类分析。观察到胃源细胞明显与结直肠样细胞分开(下图1)。我们还在队列和患者水平上使用单细胞共识聚类(SC3)对肿瘤细胞进行了无监督的聚类分析，将细胞分组成簇，显示出不同细胞系组成的显著差异。例如，IP-的肿瘤细胞被SC3分成四个簇。C1组细胞主要为胃源细胞(96.5%)，只有3.5%的细胞为结直肠样细胞；而C4组细胞主要为肠源细胞，71.4%的细胞为结直肠样细胞。C4组细胞高表达肠源细胞的marker基因如DMBT1FCGBP,PIGR和WFDC2；而C1群细胞高表达胃源细胞marker基因如PSCA和TFF1。总之，结果表明转录组ITH可能是肿瘤细胞谱系组成的多样性的一个贡献因素。

研究人员继续研究了PC肿瘤细胞CNV与推断的肿瘤细胞谱系的关联，并观察到了肿瘤细胞CNV的异质性。在IP-样品中（下图），分出了拥有五种不同CNV特征的亚群（B1-5），CNV亚克隆模式与推断的肿瘤细胞谱系一致：最大亚群B5显示出结肠样转录组谱，其多个染色体上的CNV谱与纯胃源细胞组成的B2亚群存在明显差异。同时，B5细胞在Monocle细胞簇C1中富集，而B2细胞主要在簇C3中，在MonocleUMAP图上，簇C1与C3细胞明显分离(下图，右上)。为了进一步了解本病例的ITH，研究人员针对3‘UTR进行了体细胞变异分析，结果发现C1细胞中发现的36%的体细胞突变未在C2或C3细胞中检测到;总的来说，所有三个集群中只有26%的突变是共享的。

研究者分析了所有病例的inferCNV，发现17q拷贝数扩增是胃源性细胞特有的CNV并且出现在生存期短的患者样本中。在两个独立的GAC队列中进行了验证分析：TCGA初级GAC队列(n=)和转移性胃癌队列(n=45)。来自两个验证队列的数据显示，肿瘤增加17q的患者生存率明显较差，17q拷贝数扩增与不良预后相关。

基于细胞起源组分的不同，研究者将肿瘤样本分为Gastric-dominant（主要为胃癌细胞）和GI-mixed（胃癌与肠来源混合细胞）两种类型。通过两组间的生存分析，研究者发现Gastric-dominant组的患者预后较差，而GI-mixed组的患者预后较好（下图）。

研究者进一步基于两组间的基因表达差异鉴定了和患者生存相关的基因组特征（12-genesignature）。最后对该signature在独立的胃癌腹腔转移数据库和4组公共的原发胃癌数据库中的预后效能进行了验证，结果显示该组基因特征均具有很强的预后分类效能，多因素Cox回归分析显示，该特征是生存期短的一个强有力的预后预测因子，风险比为12.7(P＜0.)，并且独立于临床/组织病理学变量。

研究人员还在其他4个大规模GAC队列（共计例病例）中评估了其预后意义。值得注意的是，虽然12genesigniture来自于晚期的GAC队列，但它在所有四个晚期GAC验证队列中仍然能区分出预后的好坏，具有预后意义，且独立于其他分子和临床亚型特征。

原文链接:Single-celldissectionofintratumoralheterogeneityandlineagediversityinmetastaticgastricadenocarcinoma

NatureMedicine

胃肠学术前沿与进展

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